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灭菌

发布日期:2016-01-21 21:49

时间:2016-01-21 21:49:37

灭菌是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀死。灭菌法是指杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽孢或孢子的技术。微生物包括细菌、真菌、病毒等。微生物的种类不同、则灭菌方法不同,灭菌效果也不同。细菌的芽孢具有较强的抗热能力,因此灭菌效果,常以杀灭芽孢为准。消毒是指杀灭物体上的微生物的繁殖体,不能保证杀死芽孢或孢子。灭菌与消毒在药品生产过程中是极为重要的,它是药品生产过程中一项重要的操作,也是保证药品质量的重要措施之一。
灭菌涉及到厂房、设备、容器、洁具、工作服装、原辅材料、成品、包装材料,仪器等等的灭菌。无菌药品特别是注射液、供角膜创伤或手术用滴眼剂等无菌制剂是直接进入人体血液循环系统而产生疗效的药品,所以对其质量有特殊要求,它必须符合药典无菌检查的要求。为此,在生产过程中,要努力消除微生物的污染,杀灭药品中的微生物,这就是灭菌要达到的目的。
灭菌的方法基本上分为二大类:物理方法(干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌、滤过灭菌)和化学方法(气体灭菌、药液灭菌)。下面将分别介绍几种常用的灭菌方法。
第一节  干热灭菌法及其设备
一、干热灭菌
干热可用于能耐受较高温度,却不宜被蒸汽穿透,或者易被湿热破坏的物品的灭菌。同时干热也是制药工业中用于除热原的方法之一。由于在相同的温度下,干热对微生物的杀灭效果远低于饱和蒸汽,故干热灭菌需要较高的温度或较长的灭菌时间。
凡用湿热灭菌法无效的非水性物质或极粘稠的液体如甘油、液状石蜡、油类等可用本法灭菌。灭菌时,油类、软膏基质或粉末应铺成不超过0.6cm的薄层,使热更好的透入。
评价干热法灭菌的相对灭菌能力时,一般可采用相似于Fo值的致死率单位和生物指示剂。Fo值与湿热灭菌系统验证中使有的Fo值的不同点是:评价干热灭菌过程的相对灭菌能力的Fo值是将时间与温度条件的改变折算成170℃时的相当时间,同时设定Z值为20℃即FH值。BP1993年版规定,仅以灭菌为最终目的干热灭菌系统,必须保证其最小的FH值大于170℃   60min。对于采用干热存活概率法灭菌的系统,验证结果应能证明其灭菌过程保证对耐热微生物的杀灭效果达到认可的低存活概率,一般未被杀灭的概率为10~6,即灭菌物品经过灭菌后残存微生物污染的可能性为百万分之一。对于采用干热过度杀灭法灭菌系统的验证结果,应证明其灭菌过程保证对干热呈高度耐受性的微生物产生大于12个log的递减,取得低于10~12的微生物存活概率,即灭菌物品经过灭菌后残存的微生物污染可能性低于百万分之一,同时在做过度杀灭法灭菌过程验证时不需要做常规的带菌量的估价。
二、干热灭菌的主要设备
干热灭菌的主要设备有干热灭菌柜、隧道灭菌系统。干热灭菌设备一般由下列几个重要部分组成:
1、加热器——它是干热灭菌设备的主要组成部分,对灭菌效果的好坏影响极大。加热器故障是造成干热灭菌设备灭菌效果下降的主要原因之一,其主要表现为升温速度下降;影响热分布;产生尘埃物质。而造成加热器故障的原因主要是加热器的长期使用或通过加热器的空气质量较差所致。所以一般应在灭菌器的加热系统配置电流监测器,以及时发现其故障。
2、高效过滤器——在干热灭菌设备中,进风应通过高效过滤器;除去内部空气循环系统中产生的尘埃物质需要高效过滤器,防止排风倒流的污染也可装高效过滤器。所以高效过滤器必须满足干热灭菌工艺用风量的要求,并能承受相应的风压。
3、缓冲板、风阀、气流调节器或空气档板——缓冲板或空气档板用于控制干热灭菌器的空气流量,多安装于进风或排风风管或加热器附近,用于正压控制。气流调节器可以安装排风系统中的防止倒流风污染的高效过滤器附近,通过控制排风量控制正压,也可以用气流调节器控制进风和排风风量以保持正压。一般情况下,干热灭菌器腔室内的压力略高于其相临的非无菌区而略低于其相临的无菌区。
4、风机——对干热灭菌器中的气流循环影响很大,风机的风量应该可以测量,并可调整,必要时可以要求供应商将此项要求增加到其设备标准中,因为风机风量的测量指示值,可以为设备使用过程中检查风机状态提供依据。
5、传送带(仅适用于连续法)——传送带的速度,在连续传送干热灭菌系统中是十分重要的灭菌效果影响因素。目前大多数干热连续法灭菌系统中已设有传送带速度控制器,但较少有速度记录装置。由于传送带速度决定了物料经过灭菌器时所接受的热量,所以其速度记录是证明灭菌器在控制状态下运行的基本资料之一,生产工艺中亦有必要保存每次灭菌过程的传送带速度的记录。同时干热灭菌器的SOP,也应明确规定各种灭菌过程传送带的运行速度范围,此运行速度范围应是经过验证确定的。
6、运行连锁控制系统——干热灭菌器中连锁控制系统设有:门连锁控制系统;压力传感器;温度传感、控制、停止传送带运行的连锁控制装置等,以保证在任何情况下出现温度低于设计要求时防止灭菌物品在低于灭菌温度的情况下通过灭菌器。
7、温度控制器及记录仪——在干热灭菌系统中,温度探测、传感、控制、记录系统是整个灭菌过程控制的基础,其控制系统必须能保证灭菌器腔室内灭菌温度可以保持在设定的灭菌温度范围内,其记录系统必须将温度探测、传感系统的温度读数准确无误地记录清楚。
第二节  湿热灭菌法及其设备
一、湿热灭菌法
是在饱和蒸汽或沸水或流通蒸汽中进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大,穿透力强,容易使蛋白质变性或凝固,所以灭菌效率比干热灭菌法高。这是注射剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法,它具有灭菌可靠,操作方便,易于控制和经济等优点。但不适用于对湿热不稳定的药物的灭菌。
影响湿热灭菌的因素有:
1、细菌的种类与数量:不同细菌,同一细菌的不同发育阶段对热的抵抗力有所不同。细菌数越少,灭菌时间越短,如注射剂中即使细菌全部杀死,而注射液中的细菌尸体过多,也会引起临床上的不良反应。
2、药物性质与灭菌时间:一般来说,灭菌温度越高灭菌时间越短,但考虑到药物的稳定性,应在达到有效灭菌的前题下可适当降低灭菌温度或缩短灭菌时间。如维生素C注射液用流通蒸汽15分钟灭菌,Nacl输液115℃30分钟灭菌。
3、蒸汽的性质:蒸汽有饱和蒸汽,湿饱和蒸汽和过热蒸汽。饱和蒸汽热含量较高,热穿透力较大,因此灭菌效力高。湿饱和蒸汽带有水分,热含量较低,穿透力差,灭菌效力较低。过热蒸汽温度高于饱和蒸汽,但穿透力差,灭菌效率低。
4、介质的性质:制剂中含有营养物质,如糖类、蛋白质等,增强细菌的抗热性。细菌的生存能力也受介质PH值的影响。一般中性环境耐热性最大,碱性次之,酸性不利于细菌发育。
二、湿热灭菌法的主要设备
湿热灭菌法的主要设备是灭菌釜,灭菌釜种类很多,性能差异也很大,但其基本结构大同小异,所用的材质为坚固的合金。现在国内很多企业使用的方型高压灭菌釜,能密闭耐压,有排气口、安全阀、压力和温度指示装置。带有夹套的灭菌柜备有带轨道的格车,分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表二只,一只指示蒸汽夹套内的压力,另一只指示柜室内的压力,两压力表中间为温度计。灭菌柜的上方还应安装排气阀,以便开始通入加热蒸汽时排除不凝性气体。近年来,有些制药企业已经开始采用具有抽真空能力及Fo控制的蒸汽灭菌釜,目前国内采用的进口灭菌釜主要有二种:一种以蒸汽为灭菌介质的旋转式灭菌釜,如奥地利的HDRR009.20/IS,另一种以过热水作介质的喷淋式灭菌釜,如意大利FEDEGARI公司的FOW5—500。进口灭菌釜的主要优点是批次量较大,温度控制系统准确度及精密度较好,产品灭菌过程中受热比较均匀。
灭菌釜的基本灭菌程序为:
装瓶   →  升温、进蒸汽置换空气  →  灭菌  → 排汽→ 预热水冷却 →卸瓶。
三、脉动真空灭菌器使用的注意事项:
1、必须将灭菌器内的空气排出。如果灭菌器内有空气存在,则表上所表示的压力是蒸汽和空气二者的总压而非单纯的蒸汽压力。结果压力虽然达到预定水平,但温度达不到。若表压与温度表指示不一致,则有可能空气没有排尽,也可能压力表失灵,也可能是不饱和蒸汽,应找出原因加以解决。
2、灭菌时间必须由全部药液真正达到所要求的温度时算起,湿热灭菌时的预热时间(升温时间)虽可较干热时间的短,但测定和缩短预热时间的重要性,也决不次于干热灭菌。例如250ml —500ml玻瓶输液,预热时间一般为15~30分钟,多者可达45分钟。
3、灭菌完毕后,停止加热,一般须使压力表所指示的压力逐渐下降到零后,才能放出锅内蒸汽,使锅内压力与大气压相等后,稍稍打开灭菌锅,待10~15分钟后,再全部打开。这样可避免内外压力差太大而使物品冲出锅外和使玻璃瓶爆裂。这点必须注意以免发生工伤事故。为了缩短灭菌周期,也有往灭菌器内盛装有溶液的封闭容器喷雾冷却水,加速冷却。以水温18℃,雾滴大小80μm的喷雾时的冷却效果最大,过冷过粗的喷雾将引起瓶子的爆破。对于灭菌后要求干燥但又不易破损的物料,灭菌后立即放出灭菌器内蒸汽,以利干燥。
四、流通蒸汽灭菌法和煮沸灭菌法
流通蒸汽灭菌法是在不密闭的容器内,用蒸汽灭菌,压力与大气压相等,即100℃的蒸汽灭菌。目前我国药厂生产注射剂,特别是1~2ml的注射剂及不耐高温的品种,基本上都采用此法,煮沸灭菌法就是把安瓿或其它物品放入水中煮沸灭菌。流通蒸汽灭菌与煮沸灭菌,一般是100℃30分钟至60分钟。此法不能保证杀灭所有芽孢,例如破伤风杆菌等厌氧性细菌的芽孢,故制备过程中要尽可能避免污染。可用热压灭菌器开启排汽阀进行灭菌。在农村或野战条件下亦可采用蒸笼来灭菌,若在高原地区,由于水的沸点降低,因此在水中常加入1~2%碳酸钠,5%苯酚等以提高水的沸点;但也有用延长灭菌时间的方法来解决的。一般每升高300公尺,延长灭菌时间20%。此法对增殖型微生物的灭菌效果大,但不能保证杀灭芽孢。
五、低温间歇灭菌法
此法是将待灭菌的制品,用60~80℃加热1小时,将其中的细菌繁殖体杀死,然后在室温或孵卵箱中放置24小时其中芽孢发育成繁殖体,再第二次灭菌。连续操作三次以上,至全部芽孢消灭净为止。此法适用于必须用热法灭菌但又不耐较高温度的制剂或药品。缺点是时间长,消灭芽孢的效果不够完全。应用本法灭菌的制剂或药品,除本身具有抑菌力者外,须加适量抑菌剂,以增加灭菌效力。
以上几种灭菌方法为湿热灭菌法的几种灭菌方式,本厂现采用热压灭菌法和煮沸灭菌法,如口服液车间采用对药液采用煮沸灭菌40分钟,对C型瓶、瓶盖采用121℃20分钟或105℃30分钟灭菌,如果口服液采用最终灭菌时,灌封完成的药品在规定时间内采用105℃30分钟灭菌。
第三节  其他灭菌方法及消毒方法
一、辐射灭菌法
以放射性同位素(60C0或137Cs)放射的γ射线杀菌的方法。射线可使有机化合物的分子直接发生电离,产生破坏正常代谢的自由基,导致微生物体内的分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度,穿透性强,适合于不耐热药物的灭菌,医疗器械、高分子材料、包装材料等灭菌。灭菌剂量一般可用2.5×104GY(戈瑞)。此法已为《英国药典》(1998),《日本药局方》十三版所载。我国有些企业亦有用60C0对某些中药和医疗器械进行灭菌。辐射灭菌,制备费用高,对某些药品可能产生药效降低,产生毒性物质或发热物质,使用辐射灭菌还应注意安全防护措施。
二、紫外线灭菌法
是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm,灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性,同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧,从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播,可被不同的表面反射,穿透力微弱,但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌;不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌;普通玻璃可吸收紫外线,因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久,会发生结膜炎,红斑及皮肤烧灼等现象,故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时,关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌,则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏,离地面2.5~3m为宜。
用紫外线照射灭菌时要注意下列问题:
1、紫外线的杀菌力,随使用时间增加而减退,一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管,以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。
2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同,杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。
3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计,室内湿度增加时,照射量应相应增加。
4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关,这需要通过验证来确定照射时间。
5、紫外照射灯的安装形式及高度,应根据实际情况,参考使用说明决定。
三、环氧乙烷灭菌法
环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法,可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。环氧乙烷灭菌系统,主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果:
1、温度;
2、湿度;
3、气体浓度;
4、灭菌时间。
因为环氧乙烷是易燃易爆物质,明火可以引起燃烧,同时由于气体分解还可能引起爆炸,环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。
环氧乙烷具有非常强的渗透和扩散能力,其灭菌的机理主要是强氧化,因此具有杀菌谱广,灭菌能力强的特点,对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。虽然环氧乙烷在高浓度时有刺激性臭味和毒性,但属中度毒性,一般可以很快挥发,不会在系统内表面残留余毒。
灭菌机理主要是它的烷基的取代性质、细菌蛋白质分子中的-cooH、-NH2、- OH、SH基上的氢原子被环氧乙烷的羟乙基基团所取代而使菌体细胞的代谢产生不可逆性的破坏。
CH2-CH2 +R-SH→R-S-CH2-CH2OHo
        R-SH代表含巯基的蛋白分子。
用环氧乙烷气体灭菌的程序,大致为将灭菌物品置于灭菌器内,减压排除空气,预热,环氧乙烷气体采用混合气(一般环氧乙烷气体含10-20%,二氧化碳含80~90%),在减压下输人混合气体,保持一定浓度、温度和湿度,经过一定时间后,抽真空排除环氧乙烷气体,然后送入无菌空气置换环氧乙烷气体,直至换净。
四、滤过灭菌法
滤过灭菌法是用滤过方法除去活的或死的微生物的方法,是一种机械除菌方法,这种机械叫除菌过滤器。主要用于对热不稳定的药物溶液、气体、水的除菌。供灭菌用的滤器,要求能有效地从溶液中除净微生物,溶液顺畅地由滤器通过,滤液中不落入任何不需要的物质,滤器容易清洗,操作简便。
繁殖型细菌很少有小于1μm的,芽胞大小为0.5μum或更小些。所以,对于以过筛作用滤过的滤器,例如纤维素酯膜滤器,其孔径大小必须小到足以阻止细菌和芽孢进入滤孔之内,孔径约为0.2μm。靠阻留于孔道内或静电作用的滤器孔径可稍大于所要滤除的颗粒,但压力过大或波动,颗粒就有被挤过的可能。通常用测定孔径的方法,是用大小为0.7μm左右的灵菌(B.prodigilsus)混悬液滤过,滤液通过培养实验,观察有无灵菌生长。常用除菌滤器有微孔薄膜器,摺叠式纤维素滤棒,一般选用孔径0.22μm。滤过法应配合无菌操作技术,并必须对成品进行无菌检查,以保证其除菌质量。滤膜以CH2-CH2灭菌为宜。                                      O
五、臭氧消毒法
臭氧(O3)的消毒原理是:臭氧在常温、常压下分子结构不稳定,很快自行分解成氧(O2)和单个氧原子(O),后者具有很强的活性,对细菌有极强的氧化作用,臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶,从而破坏其细胞膜,将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子(O2),不存在任何有害残留物,故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌(包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等)有极强的杀灭能力,而且对霉菌也很有效。
生产臭氧的原料主要是电能和空气,一般通过高频臭 氧发生器(电子消毒器)来获得,消毒时,直接将臭氧发生器置于房间中间即可。
臭氧消毒效果的验证中需确认和校正的臭氧发生器技术指标有:臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器,并通过验证检查细菌数来确定消毒时间。
六、甲醛消毒方法
1、计算房间体积,按10g/m3的比例称出甲醛。
2、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中,并放好加湿用水,必要时还需加入高锰酸钾(2~3g/m3),然后加热(甲醛发生器用蒸汽加热,加热盘或烧杯用热水盛入其中加热)使其蒸发成气体。
3、灭菌流程:空调器停止运转→ 启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛  →让甲醛气体扩散约30分钟→ 启动空调器让甲醛气体循环约30分钟 →停止空调器,房间熏蒸消毒,时间不少于8小时 → 房间排气,用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。
当相对湿度在65%以上,温度在24~40℃时,甲醛气体的消毒效果最好。
甲醛消毒灭菌的气体发生量、熏蒸时间、换气时间等应以验证结果来最后确定。也有报导过氧乙酸用于车间的室内灭菌,效力比相同浓度的甲醛大两倍半,对粘膜无刺激性,对木、金属制品、医疗器械无影响。
七、消毒剂消毒
洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手(手套)在环境验证及日常生产时,应定期清洁并用消毒剂喷洒,常见的消毒剂有异丙醇(75%)、乙醇(75%)、戊二醛(1%)、新洁而灭(0.1~0.2%)等。亦可用0.5~3%石碳酸或2~5%的甲苯酚。
无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中,用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。
第四节灭菌管理要点
一、选用滤过器材和处理方法应符合工艺要求,微孔滤膜使用前后应作完整性试验,以保证其灭菌效果。
二、药液从配制到灭菌开始,其间隔不得超过工艺规定的时间。
三、灭菌应有温度、压力及升温时间、恒温时间、数量及全过程的温度压力曲线图或温度曲线图。
四、按批号进行灭菌,不得混批。灭菌前后的中间产品应有可靠的防混措施。
五、灭菌设备使用前都必须进行验证,工艺改变或大修后,要进行再验证,以确保灭菌效果。
六、灭菌釜宜选择双扉式的灭菌釜,使用前应进行温度均匀性和灭菌效果的验证,并有记录,FO值应控制在8.0以上。
七、直接接触药品的包装材料、设备和其他物品的从灭菌到使用时间间隔应有规定。
八、当一个批号产品使用多个灭菌柜灭菌时,应加亚批号。
第五节蒸汽灭菌釜验证
蒸气灭菌釜验证,一般的验证步骤如下:
一、验证方案的制订;
二、验证方案的批准;
三、仪表及文件的准备;
四、预确认;
五、安装确认——电气安装、蒸汽安装、冷支却水安装;
六、运行确认——单机或系统试车。
七、性能确认——热分布测试、热穿透性试验、生物指示剂验证试验、微生物孢子的挑战性试验。
八、验证报告——数据分析、验证结果、评价和建议。
九、批准结论。
蒸汽灭菌釜验证如何进行,原国家医药管理局批准GMP、GSP委员会编写《药品生产验证指南》(1996年4月出版)P263附录四“灭菌釜验证示例”可供参考。


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灭菌

发布日期:2016-01-21 21:49

时间:2016-01-21 21:49:37

灭菌是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀死。灭菌法是指杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽孢或孢子的技术。微生物包括细菌、真菌、病毒等。微生物的种类不同、则灭菌方法不同,灭菌效果也不同。细菌的芽孢具有较强的抗热能力,因此灭菌效果,常以杀灭芽孢为准。消毒是指杀灭物体上的微生物的繁殖体,不能保证杀死芽孢或孢子。灭菌与消毒在药品生产过程中是极为重要的,它是药品生产过程中一项重要的操作,也是保证药品质量的重要措施之一。
灭菌涉及到厂房、设备、容器、洁具、工作服装、原辅材料、成品、包装材料,仪器等等的灭菌。无菌药品特别是注射液、供角膜创伤或手术用滴眼剂等无菌制剂是直接进入人体血液循环系统而产生疗效的药品,所以对其质量有特殊要求,它必须符合药典无菌检查的要求。为此,在生产过程中,要努力消除微生物的污染,杀灭药品中的微生物,这就是灭菌要达到的目的。
灭菌的方法基本上分为二大类:物理方法(干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌、滤过灭菌)和化学方法(气体灭菌、药液灭菌)。下面将分别介绍几种常用的灭菌方法。
第一节  干热灭菌法及其设备
一、干热灭菌
干热可用于能耐受较高温度,却不宜被蒸汽穿透,或者易被湿热破坏的物品的灭菌。同时干热也是制药工业中用于除热原的方法之一。由于在相同的温度下,干热对微生物的杀灭效果远低于饱和蒸汽,故干热灭菌需要较高的温度或较长的灭菌时间。
凡用湿热灭菌法无效的非水性物质或极粘稠的液体如甘油、液状石蜡、油类等可用本法灭菌。灭菌时,油类、软膏基质或粉末应铺成不超过0.6cm的薄层,使热更好的透入。
评价干热法灭菌的相对灭菌能力时,一般可采用相似于Fo值的致死率单位和生物指示剂。Fo值与湿热灭菌系统验证中使有的Fo值的不同点是:评价干热灭菌过程的相对灭菌能力的Fo值是将时间与温度条件的改变折算成170℃时的相当时间,同时设定Z值为20℃即FH值。BP1993年版规定,仅以灭菌为最终目的干热灭菌系统,必须保证其最小的FH值大于170℃   60min。对于采用干热存活概率法灭菌的系统,验证结果应能证明其灭菌过程保证对耐热微生物的杀灭效果达到认可的低存活概率,一般未被杀灭的概率为10~6,即灭菌物品经过灭菌后残存微生物污染的可能性为百万分之一。对于采用干热过度杀灭法灭菌系统的验证结果,应证明其灭菌过程保证对干热呈高度耐受性的微生物产生大于12个log的递减,取得低于10~12的微生物存活概率,即灭菌物品经过灭菌后残存的微生物污染可能性低于百万分之一,同时在做过度杀灭法灭菌过程验证时不需要做常规的带菌量的估价。
二、干热灭菌的主要设备
干热灭菌的主要设备有干热灭菌柜、隧道灭菌系统。干热灭菌设备一般由下列几个重要部分组成:
1、加热器——它是干热灭菌设备的主要组成部分,对灭菌效果的好坏影响极大。加热器故障是造成干热灭菌设备灭菌效果下降的主要原因之一,其主要表现为升温速度下降;影响热分布;产生尘埃物质。而造成加热器故障的原因主要是加热器的长期使用或通过加热器的空气质量较差所致。所以一般应在灭菌器的加热系统配置电流监测器,以及时发现其故障。
2、高效过滤器——在干热灭菌设备中,进风应通过高效过滤器;除去内部空气循环系统中产生的尘埃物质需要高效过滤器,防止排风倒流的污染也可装高效过滤器。所以高效过滤器必须满足干热灭菌工艺用风量的要求,并能承受相应的风压。
3、缓冲板、风阀、气流调节器或空气档板——缓冲板或空气档板用于控制干热灭菌器的空气流量,多安装于进风或排风风管或加热器附近,用于正压控制。气流调节器可以安装排风系统中的防止倒流风污染的高效过滤器附近,通过控制排风量控制正压,也可以用气流调节器控制进风和排风风量以保持正压。一般情况下,干热灭菌器腔室内的压力略高于其相临的非无菌区而略低于其相临的无菌区。
4、风机——对干热灭菌器中的气流循环影响很大,风机的风量应该可以测量,并可调整,必要时可以要求供应商将此项要求增加到其设备标准中,因为风机风量的测量指示值,可以为设备使用过程中检查风机状态提供依据。
5、传送带(仅适用于连续法)——传送带的速度,在连续传送干热灭菌系统中是十分重要的灭菌效果影响因素。目前大多数干热连续法灭菌系统中已设有传送带速度控制器,但较少有速度记录装置。由于传送带速度决定了物料经过灭菌器时所接受的热量,所以其速度记录是证明灭菌器在控制状态下运行的基本资料之一,生产工艺中亦有必要保存每次灭菌过程的传送带速度的记录。同时干热灭菌器的SOP,也应明确规定各种灭菌过程传送带的运行速度范围,此运行速度范围应是经过验证确定的。
6、运行连锁控制系统——干热灭菌器中连锁控制系统设有:门连锁控制系统;压力传感器;温度传感、控制、停止传送带运行的连锁控制装置等,以保证在任何情况下出现温度低于设计要求时防止灭菌物品在低于灭菌温度的情况下通过灭菌器。
7、温度控制器及记录仪——在干热灭菌系统中,温度探测、传感、控制、记录系统是整个灭菌过程控制的基础,其控制系统必须能保证灭菌器腔室内灭菌温度可以保持在设定的灭菌温度范围内,其记录系统必须将温度探测、传感系统的温度读数准确无误地记录清楚。
第二节  湿热灭菌法及其设备
一、湿热灭菌法
是在饱和蒸汽或沸水或流通蒸汽中进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大,穿透力强,容易使蛋白质变性或凝固,所以灭菌效率比干热灭菌法高。这是注射剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法,它具有灭菌可靠,操作方便,易于控制和经济等优点。但不适用于对湿热不稳定的药物的灭菌。
影响湿热灭菌的因素有:
1、细菌的种类与数量:不同细菌,同一细菌的不同发育阶段对热的抵抗力有所不同。细菌数越少,灭菌时间越短,如注射剂中即使细菌全部杀死,而注射液中的细菌尸体过多,也会引起临床上的不良反应。
2、药物性质与灭菌时间:一般来说,灭菌温度越高灭菌时间越短,但考虑到药物的稳定性,应在达到有效灭菌的前题下可适当降低灭菌温度或缩短灭菌时间。如维生素C注射液用流通蒸汽15分钟灭菌,Nacl输液115℃30分钟灭菌。
3、蒸汽的性质:蒸汽有饱和蒸汽,湿饱和蒸汽和过热蒸汽。饱和蒸汽热含量较高,热穿透力较大,因此灭菌效力高。湿饱和蒸汽带有水分,热含量较低,穿透力差,灭菌效力较低。过热蒸汽温度高于饱和蒸汽,但穿透力差,灭菌效率低。
4、介质的性质:制剂中含有营养物质,如糖类、蛋白质等,增强细菌的抗热性。细菌的生存能力也受介质PH值的影响。一般中性环境耐热性最大,碱性次之,酸性不利于细菌发育。
二、湿热灭菌法的主要设备
湿热灭菌法的主要设备是灭菌釜,灭菌釜种类很多,性能差异也很大,但其基本结构大同小异,所用的材质为坚固的合金。现在国内很多企业使用的方型高压灭菌釜,能密闭耐压,有排气口、安全阀、压力和温度指示装置。带有夹套的灭菌柜备有带轨道的格车,分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表二只,一只指示蒸汽夹套内的压力,另一只指示柜室内的压力,两压力表中间为温度计。灭菌柜的上方还应安装排气阀,以便开始通入加热蒸汽时排除不凝性气体。近年来,有些制药企业已经开始采用具有抽真空能力及Fo控制的蒸汽灭菌釜,目前国内采用的进口灭菌釜主要有二种:一种以蒸汽为灭菌介质的旋转式灭菌釜,如奥地利的HDRR009.20/IS,另一种以过热水作介质的喷淋式灭菌釜,如意大利FEDEGARI公司的FOW5—500。进口灭菌釜的主要优点是批次量较大,温度控制系统准确度及精密度较好,产品灭菌过程中受热比较均匀。
灭菌釜的基本灭菌程序为:
装瓶   →  升温、进蒸汽置换空气  →  灭菌  → 排汽→ 预热水冷却 →卸瓶。
三、脉动真空灭菌器使用的注意事项:
1、必须将灭菌器内的空气排出。如果灭菌器内有空气存在,则表上所表示的压力是蒸汽和空气二者的总压而非单纯的蒸汽压力。结果压力虽然达到预定水平,但温度达不到。若表压与温度表指示不一致,则有可能空气没有排尽,也可能压力表失灵,也可能是不饱和蒸汽,应找出原因加以解决。
2、灭菌时间必须由全部药液真正达到所要求的温度时算起,湿热灭菌时的预热时间(升温时间)虽可较干热时间的短,但测定和缩短预热时间的重要性,也决不次于干热灭菌。例如250ml —500ml玻瓶输液,预热时间一般为15~30分钟,多者可达45分钟。
3、灭菌完毕后,停止加热,一般须使压力表所指示的压力逐渐下降到零后,才能放出锅内蒸汽,使锅内压力与大气压相等后,稍稍打开灭菌锅,待10~15分钟后,再全部打开。这样可避免内外压力差太大而使物品冲出锅外和使玻璃瓶爆裂。这点必须注意以免发生工伤事故。为了缩短灭菌周期,也有往灭菌器内盛装有溶液的封闭容器喷雾冷却水,加速冷却。以水温18℃,雾滴大小80μm的喷雾时的冷却效果最大,过冷过粗的喷雾将引起瓶子的爆破。对于灭菌后要求干燥但又不易破损的物料,灭菌后立即放出灭菌器内蒸汽,以利干燥。
四、流通蒸汽灭菌法和煮沸灭菌法
流通蒸汽灭菌法是在不密闭的容器内,用蒸汽灭菌,压力与大气压相等,即100℃的蒸汽灭菌。目前我国药厂生产注射剂,特别是1~2ml的注射剂及不耐高温的品种,基本上都采用此法,煮沸灭菌法就是把安瓿或其它物品放入水中煮沸灭菌。流通蒸汽灭菌与煮沸灭菌,一般是100℃30分钟至60分钟。此法不能保证杀灭所有芽孢,例如破伤风杆菌等厌氧性细菌的芽孢,故制备过程中要尽可能避免污染。可用热压灭菌器开启排汽阀进行灭菌。在农村或野战条件下亦可采用蒸笼来灭菌,若在高原地区,由于水的沸点降低,因此在水中常加入1~2%碳酸钠,5%苯酚等以提高水的沸点;但也有用延长灭菌时间的方法来解决的。一般每升高300公尺,延长灭菌时间20%。此法对增殖型微生物的灭菌效果大,但不能保证杀灭芽孢。
五、低温间歇灭菌法
此法是将待灭菌的制品,用60~80℃加热1小时,将其中的细菌繁殖体杀死,然后在室温或孵卵箱中放置24小时其中芽孢发育成繁殖体,再第二次灭菌。连续操作三次以上,至全部芽孢消灭净为止。此法适用于必须用热法灭菌但又不耐较高温度的制剂或药品。缺点是时间长,消灭芽孢的效果不够完全。应用本法灭菌的制剂或药品,除本身具有抑菌力者外,须加适量抑菌剂,以增加灭菌效力。
以上几种灭菌方法为湿热灭菌法的几种灭菌方式,本厂现采用热压灭菌法和煮沸灭菌法,如口服液车间采用对药液采用煮沸灭菌40分钟,对C型瓶、瓶盖采用121℃20分钟或105℃30分钟灭菌,如果口服液采用最终灭菌时,灌封完成的药品在规定时间内采用105℃30分钟灭菌。
第三节  其他灭菌方法及消毒方法
一、辐射灭菌法
以放射性同位素(60C0或137Cs)放射的γ射线杀菌的方法。射线可使有机化合物的分子直接发生电离,产生破坏正常代谢的自由基,导致微生物体内的分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度,穿透性强,适合于不耐热药物的灭菌,医疗器械、高分子材料、包装材料等灭菌。灭菌剂量一般可用2.5×104GY(戈瑞)。此法已为《英国药典》(1998),《日本药局方》十三版所载。我国有些企业亦有用60C0对某些中药和医疗器械进行灭菌。辐射灭菌,制备费用高,对某些药品可能产生药效降低,产生毒性物质或发热物质,使用辐射灭菌还应注意安全防护措施。
二、紫外线灭菌法
是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm,灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性,同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧,从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播,可被不同的表面反射,穿透力微弱,但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌;不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌;普通玻璃可吸收紫外线,因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久,会发生结膜炎,红斑及皮肤烧灼等现象,故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时,关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌,则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏,离地面2.5~3m为宜。
用紫外线照射灭菌时要注意下列问题:
1、紫外线的杀菌力,随使用时间增加而减退,一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管,以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。
2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同,杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。
3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计,室内湿度增加时,照射量应相应增加。
4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关,这需要通过验证来确定照射时间。
5、紫外照射灯的安装形式及高度,应根据实际情况,参考使用说明决定。
三、环氧乙烷灭菌法
环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法,可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。环氧乙烷灭菌系统,主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果:
1、温度;
2、湿度;
3、气体浓度;
4、灭菌时间。
因为环氧乙烷是易燃易爆物质,明火可以引起燃烧,同时由于气体分解还可能引起爆炸,环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。
环氧乙烷具有非常强的渗透和扩散能力,其灭菌的机理主要是强氧化,因此具有杀菌谱广,灭菌能力强的特点,对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。虽然环氧乙烷在高浓度时有刺激性臭味和毒性,但属中度毒性,一般可以很快挥发,不会在系统内表面残留余毒。
灭菌机理主要是它的烷基的取代性质、细菌蛋白质分子中的-cooH、-NH2、- OH、SH基上的氢原子被环氧乙烷的羟乙基基团所取代而使菌体细胞的代谢产生不可逆性的破坏。
CH2-CH2 +R-SH→R-S-CH2-CH2OHo
        R-SH代表含巯基的蛋白分子。
用环氧乙烷气体灭菌的程序,大致为将灭菌物品置于灭菌器内,减压排除空气,预热,环氧乙烷气体采用混合气(一般环氧乙烷气体含10-20%,二氧化碳含80~90%),在减压下输人混合气体,保持一定浓度、温度和湿度,经过一定时间后,抽真空排除环氧乙烷气体,然后送入无菌空气置换环氧乙烷气体,直至换净。
四、滤过灭菌法
滤过灭菌法是用滤过方法除去活的或死的微生物的方法,是一种机械除菌方法,这种机械叫除菌过滤器。主要用于对热不稳定的药物溶液、气体、水的除菌。供灭菌用的滤器,要求能有效地从溶液中除净微生物,溶液顺畅地由滤器通过,滤液中不落入任何不需要的物质,滤器容易清洗,操作简便。
繁殖型细菌很少有小于1μm的,芽胞大小为0.5μum或更小些。所以,对于以过筛作用滤过的滤器,例如纤维素酯膜滤器,其孔径大小必须小到足以阻止细菌和芽孢进入滤孔之内,孔径约为0.2μm。靠阻留于孔道内或静电作用的滤器孔径可稍大于所要滤除的颗粒,但压力过大或波动,颗粒就有被挤过的可能。通常用测定孔径的方法,是用大小为0.7μm左右的灵菌(B.prodigilsus)混悬液滤过,滤液通过培养实验,观察有无灵菌生长。常用除菌滤器有微孔薄膜器,摺叠式纤维素滤棒,一般选用孔径0.22μm。滤过法应配合无菌操作技术,并必须对成品进行无菌检查,以保证其除菌质量。滤膜以CH2-CH2灭菌为宜。                                      O
五、臭氧消毒法
臭氧(O3)的消毒原理是:臭氧在常温、常压下分子结构不稳定,很快自行分解成氧(O2)和单个氧原子(O),后者具有很强的活性,对细菌有极强的氧化作用,臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶,从而破坏其细胞膜,将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子(O2),不存在任何有害残留物,故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌(包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等)有极强的杀灭能力,而且对霉菌也很有效。
生产臭氧的原料主要是电能和空气,一般通过高频臭 氧发生器(电子消毒器)来获得,消毒时,直接将臭氧发生器置于房间中间即可。
臭氧消毒效果的验证中需确认和校正的臭氧发生器技术指标有:臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器,并通过验证检查细菌数来确定消毒时间。
六、甲醛消毒方法
1、计算房间体积,按10g/m3的比例称出甲醛。
2、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中,并放好加湿用水,必要时还需加入高锰酸钾(2~3g/m3),然后加热(甲醛发生器用蒸汽加热,加热盘或烧杯用热水盛入其中加热)使其蒸发成气体。
3、灭菌流程:空调器停止运转→ 启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛  →让甲醛气体扩散约30分钟→ 启动空调器让甲醛气体循环约30分钟 →停止空调器,房间熏蒸消毒,时间不少于8小时 → 房间排气,用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。
当相对湿度在65%以上,温度在24~40℃时,甲醛气体的消毒效果最好。
甲醛消毒灭菌的气体发生量、熏蒸时间、换气时间等应以验证结果来最后确定。也有报导过氧乙酸用于车间的室内灭菌,效力比相同浓度的甲醛大两倍半,对粘膜无刺激性,对木、金属制品、医疗器械无影响。
七、消毒剂消毒
洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手(手套)在环境验证及日常生产时,应定期清洁并用消毒剂喷洒,常见的消毒剂有异丙醇(75%)、乙醇(75%)、戊二醛(1%)、新洁而灭(0.1~0.2%)等。亦可用0.5~3%石碳酸或2~5%的甲苯酚。
无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中,用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。
第四节灭菌管理要点
一、选用滤过器材和处理方法应符合工艺要求,微孔滤膜使用前后应作完整性试验,以保证其灭菌效果。
二、药液从配制到灭菌开始,其间隔不得超过工艺规定的时间。
三、灭菌应有温度、压力及升温时间、恒温时间、数量及全过程的温度压力曲线图或温度曲线图。
四、按批号进行灭菌,不得混批。灭菌前后的中间产品应有可靠的防混措施。
五、灭菌设备使用前都必须进行验证,工艺改变或大修后,要进行再验证,以确保灭菌效果。
六、灭菌釜宜选择双扉式的灭菌釜,使用前应进行温度均匀性和灭菌效果的验证,并有记录,FO值应控制在8.0以上。
七、直接接触药品的包装材料、设备和其他物品的从灭菌到使用时间间隔应有规定。
八、当一个批号产品使用多个灭菌柜灭菌时,应加亚批号。
第五节蒸汽灭菌釜验证
蒸气灭菌釜验证,一般的验证步骤如下:
一、验证方案的制订;
二、验证方案的批准;
三、仪表及文件的准备;
四、预确认;
五、安装确认——电气安装、蒸汽安装、冷支却水安装;
六、运行确认——单机或系统试车。
七、性能确认——热分布测试、热穿透性试验、生物指示剂验证试验、微生物孢子的挑战性试验。
八、验证报告——数据分析、验证结果、评价和建议。
九、批准结论。
蒸汽灭菌釜验证如何进行,原国家医药管理局批准GMP、GSP委员会编写《药品生产验证指南》(1996年4月出版)P263附录四“灭菌釜验证示例”可供参考。


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