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喷淋式灭菌柜的验证

发布日期:2015-11-20 16:15

时间:2015-11-20 16:15:37

实例1:
 
湿热灭菌设备的温度验证 
1温度验证程序设计基本要求
    湿热灭菌的基本程序设计基本要求源于US.FDA在上世纪70年代中期提出的,且在80年代施行的:“关于大容量注射剂GMP技术性原则”五个方面要求:
    (1)在灭菌工序应能确保产品达到F0 ≥ 8;
    (2)灭菌前,待实验的容器中有最高带菌量,污染菌应具有最强的耐热性;
    (3)每一个灭菌釜的每种装载方式及每种规格容器的验证实验均至少使用10支热电偶进行热分布实验;
    (4)用待实验容器灌注粘度相类似的产品进行热穿透实验,找出容器中升温最慢点的位置,至少使用10个容器,每个均加入适当的生物指示剂并且插有热电偶。当灭菌釜的参数已经达到热分布实验已经证实的可重现状态,温度达到设定的灭菌温度时,开始测定F0  值,直到开始冷却止;
    (5)当产品达到灭菌温度直到开始冷却的过程,温度变化必须保持在±0.5℃以内。
 
2温度验证的功能测试步骤
    由此技术设计要求出发,演化成为目前国内广泛采用的湿热温度验证的大容量注射剂实验方法和实验器具,也是温度验证程序设计的基本要求。使用其作功能测试步骤及参考设备如下:
    前提: 湿热灭菌设备的安装测试合格,现场和公用工程外接条件完备。即通常讲(DQ,IQ)已经结束后,位置在OQ运行确认。
2.1热分布测试  
    目的:找出最冷点位置,检验重现性。步骤:(1)设备仪器校正;(2)热电偶分布图;(3)空载热分布实验,3次以上;(4)热电偶插入图;(5)装载(模拟生产装载最大,最小量)热分布实验,各3次以上。
2.2热穿透测试 
    目的:肯定灭菌过程中被测试各点获得无菌保证值,特别是最冷点位置的F0 值,监测检验重现性。步骤:(1)设备校正;(2)模拟生产灭菌装载;(3)热电偶装载图;(4)同品同规产品最大与最小装载热穿透实验,每状态3次以上。
2.3 生物指示剂测试
    目的: 挑战性模拟生产可能因素造成的微生物污染程度来检验灭菌可靠性,对验证设计进行检验。步骤:(1)方案的设计制定;(2)生物指示剂菌株的选择,测定D值;(3)标定浓度和制定样品;(4)接种,装载;(5)低限灭菌(每产品,每规格每种灭菌程序至少3次以上);(6)样品的培养与鉴别;(7)评价结论(数据,样品分析)。
2.4 偏差与调整  
    重新设计后,重复上面步骤。
2.5 填写验证实验报告书           
3湿热灭菌温度验证对验证仪器的基本要求
    按前所述温度验证程序设计要求的技术原则的五方面内容,验证设备可包括三部分:(1)测温元件;(2)测温编辑记录仪器;(3)辅助校正仪器。
3.1测温元件
    测温元件采用敏感的多枝精密铂电阻或电偶组成,原理如图1。接线较长可以独立的摆放在灭菌设备中选定位置,每支的误差在±0.5℃以下的测试精度范围。        
    校正时,发生误差越程件应筛选。这是因为误差越程后在后面的计算中将导致F偏离,容易带来误判结果。
    电偶是温度到势能的变换器,而电阻是温度到阻值的变换器,两者在输出的信号上是不同的。从输出特性灵敏度看精密铂电阻(RTD)  为优。从测温范围上比较(-180~2000℃),价性比上热电偶较优。
    所以,经典教科书上和专家针对生产企业设备温度验证仍推荐热电偶。它是验证的温度信号采集器(精密的多只眼睛)。目前开发先进的仪器采用无线信号传送作为测温元件。测温记录仪就近接收发来的每一个信号,自动完成转换和记录、存储,但造价昂贵,特别小气,保管有特别的要求, 目前针对旋转釜国内已有使用。在灭菌釜的实际温度验证实验仪器上,国内外已经开发和生产出成熟的部件和比较先进的仪器,如GE.Kaye(US) 、raytek(US)、Sakura 、multi(Japen) 、Schlumbergez(England) 、  Goodwill(台湾固纬)、Validator2000(北京祥鸿) 等温度验证仪。
3.2测温编辑记录仪器
    测温记录仪器是整个实验的大脑。国内外诸多公司直接采用PC机开发,在Windows 系统平台基础上开发自己的多点数据记录、整理、计算、存储及I/O的接口软件,其集多功能软件为一体装配在计算机中,既便携带,又图文齐备,直观可靠。
3.3辅助校正仪器
    设计为一台高精度的恒温油槽(又称干井,见图2),采用温控PID调节控温精度高,温度波动范围设计在±0.05℃。其有断偶保护功能,上限设计超温报警功能。升降温快速、稳定、可靠。在设定温度和测量温度数字上,分别3又1/2精确显示。
    在低温段检校采取冰点槽(低温干井)设施,高低温干井分别检测电偶的特殊点温度值误差和能否用于实验的合格性进行甄别筛选。它即是本实验的检测校正部件,也是实验室的常备精密温度源。通常交国家法定技术监督部门定期检校确认合格,在有效期内使用。               
 
4电偶的布置及被灭菌物装载
    从国内许多温度验证工作开展与企业参观的实践中,专家都肯定被灭菌物装载及电偶的布置对温度验证结论有一定的影响。集中反映的问题有以下几方面:
    (1)电偶前端部分不要接触周边介质(被灭菌装载物,笼架,柜壁)。汽流和高温水流对其冲击不会发生碰撞接触和位移;
    (2)釜(胆)体喷淋板孔堵塞或加工飞边毛刺将影响水流及安置的设备平行度,也将影响水量分布和流向;
    (3)预测高温点(蒸汽入口)、低温点(凝结排放或循环水出口)与同步点(电偶位置与本柜设计检测探头处相同位置)的接线、编号与摆放方式有误。
    装载物(模拟灭菌生产类似物)的摆放模拟方式越接近实际生产,和影响热传递的模拟产品的液体粘度越接近灭菌药品粘度,摆放的电偶数量(10<N<20)越多越均匀,那么实验的可信度越大,真实误差越小,越逼真。< DIV>
    在2.4(3)所涉及点外,其余点选择视设备有所不同。如喷淋式灭菌柜,过热水是由上至下流动传递热量,验证技师强调堆码底层和堆码中心是考核重点,建议摆放在底层均布为重;又如SVP脉动灭菌釜,则强调堆码底层接近排气口周围的布置是考核重点;再如喷淋旋转式灭菌柜,过热水是由外至里流动传递热量,验证技师强调中剖面四角和中心是考核重点,建议摆放呈轴向中部层为重。而某些专家特别研究后,提出仍以可靠性和准确性为布置意图的核心思想。然而,需要对不同釜形作具体分析和实验注重均布性,取弱点代表。
    值得注意的是在设定灭菌程序一定(如121 ℃/15分,115℃/35分等)后,温度实验验证采取的实验设计参数,其装载方式和生产灭菌的正常采用方式是相同的、固定的,否则会造成检测偏差。特别强求的是,模拟生产现场条件的相似性和一致性是相当重要的条件因素。
    实际的LVP设备均为多笼车和大产量(有上万瓶/柜)的高效型。对冷点与次冷点的检测和判断必须是多次数据的综合结论。然而,使用过程存在冷点、次冷的漂移和改变属再验证确认。
    高温点的控制判断也是必须监测的参数,这将涉及到药品的高温药效评价。探头不足的情况下,可以固定装载形式后,经单笼车多次测试与对比,步步逼近搜寻冷点、次冷点、高温点等参数。同时,应和实际的生产装载形式一致,不得改变装载形式以保证应用偏差的最小化和数据的准确性。
    当然,按照生产现场的模拟情况步骤上应有最小装量和最大装量,每品每规至少3次(如设备太大,探头不够而分段测试,则数据将更多),至少3组稳定数据来考核设备的重现性和筛选热分布参数的准确性。
    加上校正、布置、辅助装载、检测、纪录分析等是验证班技工好几周的工作量。可见,试验的艰苦和细致要求,如此劳神费力是因为它的准确性对后面工作有十分重要的指导性意义。
 
5热穿透试验及标准灭菌时间F0
    热量在物理学中有传导、对流和辐射三种基本传递形式,其综合产生了强大的热穿透效果,人们关心的是热穿透效果,故取名为热穿透试验。早些书籍上有称它为带产品负荷的热分布试验,目前仍然以热穿透试验的称谓居多。目的是为了用前述实验的极值点来考核其F0值,对已经灭菌的产品是否被赋予设计的灭菌保证值进行具体数据检测考核。
    本实验的步骤和方法与装载和前述的热分布试验大体相同,差别在于温度探头的布置是插在产品中,不接触药品容器周边和底部。摆放在下列位置,并一一对应作好编号:
    (1)热分布试验确定的最冷点和次冷点;
    (2)热分布试验确定的最热点和次热点;
    (3)和灭菌柜温度控制设计探头并列(又称同步点);
    (4)纪录腔室温度探头(不插入产品中),其余和热分布位置相当,均匀布置。
    每点的温度纪录后按照时间间隔(30秒或1分)详细纪录打印,并计算每点从升温到降温过程中100℃上的F0值、各点总的F0均值、最大与最小值关键数据。
    探头使用前后都要在冰点槽和油浴槽中仔细的校正,剔除超差件。在保证重现性非常好的情况下,稳定试验数据不得低于3组。也就是本试验在某品种规格和对应某装载固定不变的工况下至少需稳定状态下作3次实验。可接受的标准是:
    (1)灭菌设计程序下各点热穿透试验获得的F0值基本一致;
    (2)最冷点F0值和产品的F0  均值之间差值小于2.5(参数的参考解释见《药品生产验证指南》1996版,221);
    (3)整体的F0值监察分析,其没有在设计的F0值允许波动的公差上下限外数据;
    (4)具备良好的重现性,连续三次以上重现性)。
    以F0值作为监察分析的历史由来已久,从经典的资料查阅可以找到,湿热灭菌中微生物杀灭的对数规则始于1921年Bigeow和Rahn等科学家的研究。他们论文的主要成果是:
    灭菌时微生物死亡遵循对数规则,过程可以用阿仑乌斯(Arrhenius)的一级反应式来描述。根据质量作用定律,在恒定温度及保持其它条件不改变的情况下,单位时间内被杀灭的微生物数正比于初始的原有数目,可以表示为以下的线性式:
    dN/dt = K (No-N ) …………(1)        
    整理后lg N t = lg No – ( K/2.303) t
    取其斜率的负倒数定义为D值,D= 2.303/K= t/ (lg N- lg N ),取(lg N- lg N )=1,D= t, 则为微生物被杀灭90%的时间。也称谓微生物九成杀灭时间,单位为分,D为正值。在USP中,D值则表示灭菌的程度。D值区分不同的微生物,在不同的温度和介质情况下数值不同,具体的数据是可以查阅的,其值越大表明微生物越难杀灭。
随着灭菌温度升高,杀灭耗用的时间越短。试验在(100~138℃)范围lg D与温度有线性关系,取其斜率的付倒数定义为Z值:
    Z  =  (T– T1 )/ lgD 1- lgD2 ---------------(2)
    Z值代表微生物被杀灭减低一个lg D数量单位所需升高的温度数值,代表微生物对热敏感系数,其值越大对热越不敏感。单位为℃ ,Z 为正值。实验选取强耐热菌株(嗜热脂肪杆菌B.Stearothermophilus)为代表的Z值在多种介质中为9.4 ,考虑Z值选取10,从安全角度既留有安全余地且对数计算应用上十分简便。
    D/ D  =  10 (T1 – T2) / Z    带入测试时间间隔Δt和效果时间多项累计求和,将T2设为参比温度T0,在变温情况下的灭菌等效式求F值计算整理,F值的数学表达式是一个多项和结果,也有直接以积分形式写出的代表式。数学多项表达式对物理特性表达较为直观: 
   
    Δt 为测量被灭菌物温度的时间间隔(一般采用1分或0.5分),分为单位;
    T为每个Δt时间间隔测得的被灭菌物温度值,℃为单位;
    T是参比温度值,℃为单位;
    Z为微生物数降低一个对数lgD值所需要升高的温度数,℃为单位;
    F ,分为单位。
    它的物理含义是在变温条件下t分钟灭菌效果与温度T (参比温度)时F分钟的灭菌效果相同等效。这是很有意义和具有非常适用价值的表达式,因为工业生产灭菌是不可能在一瞬间完成,长时间温度恒定不变的绝对理想状态也是不存在的,因而在实际的生产操作中将广泛涉及该式。
    当Z值取10℃时,这个数学表达式就剩下实测温度T和间隔时间Δt两个变量,代表各个温度值下的灭菌效果转化为121 ℃标准温度下Z值10℃下的灭菌时间效果,并记为F0
   
    上式直接由温度T和时间Δt两个物理量决定,某些书籍又称物理F0  (标准灭菌时间)。物理F0目前仅限于湿热灭菌,在试验中需要注意不能与干热、辐射等灭菌标准数据相混淆。
    它包括灭菌过程的升、保、降温过程三皆段热能对微生物总致死量效果,其是以时间为单位表示在灭菌温度121℃时等效的量值(以时间的量值来表示的代用值)。
    F0代用值能代表无菌吗?以  F0≥8为题展开,牵扯到一个容易和无菌概念混淆问题,在1995年前世界上许多从事无菌和灭菌产品的人们把F0≥8视为(当成)产品灭菌标准,好像F0≥8就等同达到产品无菌要求,而忽视其具体工艺污染控制手段问题。这是不对的,这对无菌要求在概念上属认识性的错误。
    F是指特定控制情况下被灭菌产品被污染的概率低于某值概念,赋予了产品一定的安全性而言,其是在制造过程(工艺)其他的染菌因素必须严格控制的特定情况下的。F0≥8在本设计程序下能杀灭到何种程度?是针对不同的产品和带有不同染菌数而设计的。不同染菌数样本可以在F0≥8状况下灭菌结束采取验算确认残存数或者辅之采样培养予以确认。在微生物失控情况下,根本不能称无菌。由此可见:
    没有严格的工艺制造过程染菌控制,即使F0≥8 也不能达到无菌要求,反之一样。所以,USP23(1211)不再提出将F0≥8即符合无菌要求的条款写入。因而,此概念也不能简单套用到其他无菌概念,也不能讲F0 达到多少后就达到无菌要求,这本不是同一概念。
    当然,在设计灭菌程序参数时应充分考虑增大被灭菌物的安全性,一般放大F0需作多次谨慎验证试验后才递出工艺修正报告。不能轻易放大F0,因为它是它是一把双刃剑,过度(过热)灭菌后果对药品来说很容易药效报废,并析出难以控制的杂质或(毒)副产物,毁坏药品质量,而造成一系列精心操作过程的前功尽弃,过度灭菌产品同样对病员无益。
    现在回头检查热穿透多次实验的结果。如已经达到可接受的标准了,则表明在灭菌柜最冷点(次冷点)以及最高温点(次高温点)的达到设计要求,极限点的数据表明灭菌是在设计操作程序可控制范围。既可保证腔内药品被赋予设计的足够安全性,又不在影响药效的过度灭菌温度范围。同时,同步点检测合格意味设备本身仪表反映的参数也是真实可靠,设备设计、制造与安装调试是合格的。这样为设备验证合格奠定了很好的基础,也为产品灭菌质量保证锁上了“第一把锁”。
 
6生物指示剂试验(也称为挑战性试验)
   涉及湿热灭菌的生物指示剂试验指将一定量的已知D值微生物耐热孢子接种到待灭菌的产品中,在设定的灭菌程序条件下限灭菌,以验证设定的灭菌工艺程序是否确实赋予产品所设定的F0值,由此进行的实验和评价过程也称为挑战性试验。操作步骤如下:
6.1验证方案制定的重点在产品的热稳定性、产品的污染水平与污染菌的耐热数据。
    (1)产品分析(接种模拟污染水平≥生产污染水平);
    (2)确定菌种孢子,选择强于产品常见污染菌的热耐受菌种孢子(菌种孢子含量的准确性,质量资料具备可追溯性,在有效期内);
    (3)选取非致病菌,且具有良好的重现性能;
    (4)应在接种同时留置多支阳性对照品,试验过程同步采样培养。
6.2充分采用热分布及热穿透的工作数据。
    装载和样品按照热穿透布置不变。特别关注灭菌釜的最冷点、次冷点以及同步点样品编号。
6.3设置试验温度灭菌限(也称低限灭菌)
    既低于设计值,比F低3 %~5%进行灭菌。由此而设计灭菌程序时间,如灭菌值F0 产品计算下限为8.5,设计为8.3限。
6.4按拟订下限灭菌程序结束
    (1)QC现场采样,试验编号数据和对照品编号数据同步收集;
    (2)样品按照确定菌种孢子培养要求(一般在特定温度和有好氧与厌氧条件区分);
    (3)实验样品和阳性品同条件分别培养观测。如阳性品正常培养失败,既可判试验无效而失败。因盾之不存,矛的锋利无从谈起。 
6.5为检测试验的重现性
    每一品种规格的灭菌程序至少应进行3次以上的试验,试验的数据必须稳定一致,重现性良好。否则,查找原因,重新开始。
    生物指示剂挑战性试验是一项典型的灭菌安全性评价验证,需要工艺人员试验技师和QC方面密切的配合和精确的设计。达到2.6.4与2.6.5可接受的标准后,可以证实试验成功,它代表工艺设计的灭菌程序与参数是合理的,也赋予了产品足够的安全性。另一方面,也证实前期设备的选择是符合生产需要的硬件。
    操作拟订的SOP、SMP把生产技术操作过程置于可控范围,至此本项验证工作可以告结束,转入下一项定期再验证流程。这样,为将来产品灭菌质量保证锁上了“第二把锁” 。
 
实例2
 
2.灭菌柜的验证
2.1评价标准和验证内容
    在1992年版世界卫生组织的《规范》第17章,提到对注射剂的验证要求:
    (1)17.32条:所有设备如灭菌柜、空气过滤系统、水处理系统(包括蒸馏水机)均应按计划进行验证、维护和监控。
    (2)17.55条:任何灭菌方法在正式采用前,该方法对产品的适用性以及每一装载方式下被灭菌品的所有部位是否达到规定灭菌要求都应经过验证。应定期进行再验证,每当设备有重大改变时,也须进行再验证。
    而在98版《药品GMP检查指南》中:
    (1)3102条:灭菌柜的能力是否与生产相适应,是否具有自动监测及记录装置。
    (2)*5703条:关键设备及无菌药品的验证内容是否包括灭菌设备、药液滤过及灌装(分装)系统。
    由上可见,灭菌工序对于注射剂生产的重要作用以及药政部门对灭菌柜验证的重视。而对于灭菌柜的验证,美国FDA和欧盟药品卫生组织对于不同的灭菌柜有具体的指引和要求(可以查阅有关的官方网页),我国在这方面只有02年版的《药品验证指南》大容量注射剂章节中给出对于灭菌柜验证的例子,同时05版的《药典》中关于灭菌法部分也给出更详细的要求。我们大多是参照它来制定评价标准的,笔者参考指南的例子把整个灭菌柜验证简单归纳为以下几个方面:
    (1)预确认,对灭菌柜的基本功能是否达到公司的要求进行确认;
    (2)安装确认,包括文件确认、图纸检查、主要机械部件检查、安全系统检查、公用管道连接检查、仪器仪表检查和校正、控制系统硬件部分检查、控制系统软件功能实现检查、备件备品的检查等;
    (3)运行确认,包括功能测试和基本性能参数的确认,以及对上述安装确认内容的运行时动态确认,同时根据实际情况修订操作规程和对操作人员进行实操培训;
    (4)性能确认,包括验证仪器的校验、空载热分布(腔室平均温度与冷点温差小于1.5℃)、满载热分布(腔室平均温度与冷点温差小于1.5℃)、满载热穿透的试验以及生物指示剂的挑战性试验。其中,最主要的衡量标准是灭菌阶段冷点和平均温度之差小于0.5℃和最终F0值大于8。
 
2.2灭菌柜验证操作过程
    关于预确认和安装与运行确认的内容在此省略,因为这和其他制药设备验证的基本准则是一样的。另需注意的是关于灭菌柜的安全部分和控制部分的确认,因为灭菌柜是压力容器,安全防护的措施和设置是必不可少的,这些措施既有机械方面的也应该有电器和PLC程序方面的,而灭菌效果如何则取决于控制程序和探头的精度等因素,所以要把握重点。在完成了以上的三种确认以后,就进入性能确认。
    (1)验证用的仪器,主要由三部分组成:高精度的测温探头(进口PT100热电阻温度探头)、用微机制成的测温和传送集成系统以及手提电脑(主要是电脑上用VB编写的和数据库连接的验证仪记录软件)。
    (2)使用以前当然就是要进行校正。
    (3)校正完了以后就按照布点图进行布点。1)空载热分布是指柜内不放任何玻璃瓶,只放空的灭菌架进入腔体;2)满载热分布是指按最大装载量把玻璃瓶放满灭菌架中,然后探头是放于瓶外去测温,看瓶外的温度变化;3)满载热穿透的玻璃瓶放置方法和跟满载热分布一样,只是温度检测探头的位置不一样,满载热穿透是把探头放置于盛满药液或水的瓶子中紧固,用于探测瓶内温度。
    以上每个阶段都需要进行至少连续运行3次。这里需要注意的是不同的规格都需要按最大装载量去放置,而且要按正常灭菌的程序进行灭菌,不然就失去验证的意义了(当然也可以进行挑战性试验,适当降低灭菌温度,这里不作详述),而我们在这个过程只需要观察数据就可以了。
    还有用生物指示剂进行挑战性试验,生物指示剂的选用可根据药典,但应强调所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性,用量也应大于产品中该污染菌的水平,经生物指示剂验证后,应能证明在设定的F0值条件下,产品的无菌保证水平低于106
    (4)最后验证完要对温度探头进行再次校正,验证前后偏差均应小于0.5℃为合格。
 
2.3灭菌柜验证数据分析
    验证过程做完了,轮到最关心的数据分析阶段,有很多人只关心结论是否合格?可以生产了吗?其实这是错误的,验证的核心思想是通过验证过程发现问题,了解灭菌柜的实际工作状况(特别是每年的再验证更是如此),从而解决问题,为日后的维护和检查提供依据与对照,才能知晓这个柜控制是否合理、精度如何、是否年久失修等,有经验的人就能通过对比数据就能看出来,让灭菌柜更稳定地工作才是验证目的。
    水浴式非旋转的灭菌柜温度分布特点是怎样的呢?总的来说,柜底近排水位置会相对低一些,至于哪一边温度低些则可能取决于灭菌柜的安装水平度或者由于喷淋头的堵塞状况,而柜的中间位置温度会相对温度高一些。(图3)是一个非旋转水浴式灭菌柜满载热穿透灭菌过程的温度曲线图,从上图可以看出非旋转水浴式灭菌柜柜内各点的热分布还是比较均匀的,比蒸汽式灭菌柜要好很多,但又比旋转水浴式灭菌柜要差一些,也许这就是非旋转水浴式灭菌柜成为主流灭菌柜的原因吧。


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喷淋式灭菌柜的验证

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湿热灭菌设备的温度验证 
1温度验证程序设计基本要求
    湿热灭菌的基本程序设计基本要求源于US.FDA在上世纪70年代中期提出的,且在80年代施行的:“关于大容量注射剂GMP技术性原则”五个方面要求:
    (1)在灭菌工序应能确保产品达到F0 ≥ 8;
    (2)灭菌前,待实验的容器中有最高带菌量,污染菌应具有最强的耐热性;
    (3)每一个灭菌釜的每种装载方式及每种规格容器的验证实验均至少使用10支热电偶进行热分布实验;
    (4)用待实验容器灌注粘度相类似的产品进行热穿透实验,找出容器中升温最慢点的位置,至少使用10个容器,每个均加入适当的生物指示剂并且插有热电偶。当灭菌釜的参数已经达到热分布实验已经证实的可重现状态,温度达到设定的灭菌温度时,开始测定F0  值,直到开始冷却止;
    (5)当产品达到灭菌温度直到开始冷却的过程,温度变化必须保持在±0.5℃以内。
 
2温度验证的功能测试步骤
    由此技术设计要求出发,演化成为目前国内广泛采用的湿热温度验证的大容量注射剂实验方法和实验器具,也是温度验证程序设计的基本要求。使用其作功能测试步骤及参考设备如下:
    前提: 湿热灭菌设备的安装测试合格,现场和公用工程外接条件完备。即通常讲(DQ,IQ)已经结束后,位置在OQ运行确认。
2.1热分布测试  
    目的:找出最冷点位置,检验重现性。步骤:(1)设备仪器校正;(2)热电偶分布图;(3)空载热分布实验,3次以上;(4)热电偶插入图;(5)装载(模拟生产装载最大,最小量)热分布实验,各3次以上。
2.2热穿透测试 
    目的:肯定灭菌过程中被测试各点获得无菌保证值,特别是最冷点位置的F0 值,监测检验重现性。步骤:(1)设备校正;(2)模拟生产灭菌装载;(3)热电偶装载图;(4)同品同规产品最大与最小装载热穿透实验,每状态3次以上。
2.3 生物指示剂测试
    目的: 挑战性模拟生产可能因素造成的微生物污染程度来检验灭菌可靠性,对验证设计进行检验。步骤:(1)方案的设计制定;(2)生物指示剂菌株的选择,测定D值;(3)标定浓度和制定样品;(4)接种,装载;(5)低限灭菌(每产品,每规格每种灭菌程序至少3次以上);(6)样品的培养与鉴别;(7)评价结论(数据,样品分析)。
2.4 偏差与调整  
    重新设计后,重复上面步骤。
2.5 填写验证实验报告书           
3湿热灭菌温度验证对验证仪器的基本要求
    按前所述温度验证程序设计要求的技术原则的五方面内容,验证设备可包括三部分:(1)测温元件;(2)测温编辑记录仪器;(3)辅助校正仪器。
3.1测温元件
    测温元件采用敏感的多枝精密铂电阻或电偶组成,原理如图1。接线较长可以独立的摆放在灭菌设备中选定位置,每支的误差在±0.5℃以下的测试精度范围。        
    校正时,发生误差越程件应筛选。这是因为误差越程后在后面的计算中将导致F偏离,容易带来误判结果。
    电偶是温度到势能的变换器,而电阻是温度到阻值的变换器,两者在输出的信号上是不同的。从输出特性灵敏度看精密铂电阻(RTD)  为优。从测温范围上比较(-180~2000℃),价性比上热电偶较优。
    所以,经典教科书上和专家针对生产企业设备温度验证仍推荐热电偶。它是验证的温度信号采集器(精密的多只眼睛)。目前开发先进的仪器采用无线信号传送作为测温元件。测温记录仪就近接收发来的每一个信号,自动完成转换和记录、存储,但造价昂贵,特别小气,保管有特别的要求, 目前针对旋转釜国内已有使用。在灭菌釜的实际温度验证实验仪器上,国内外已经开发和生产出成熟的部件和比较先进的仪器,如GE.Kaye(US) 、raytek(US)、Sakura 、multi(Japen) 、Schlumbergez(England) 、  Goodwill(台湾固纬)、Validator2000(北京祥鸿) 等温度验证仪。
3.2测温编辑记录仪器
    测温记录仪器是整个实验的大脑。国内外诸多公司直接采用PC机开发,在Windows 系统平台基础上开发自己的多点数据记录、整理、计算、存储及I/O的接口软件,其集多功能软件为一体装配在计算机中,既便携带,又图文齐备,直观可靠。
3.3辅助校正仪器
    设计为一台高精度的恒温油槽(又称干井,见图2),采用温控PID调节控温精度高,温度波动范围设计在±0.05℃。其有断偶保护功能,上限设计超温报警功能。升降温快速、稳定、可靠。在设定温度和测量温度数字上,分别3又1/2精确显示。
    在低温段检校采取冰点槽(低温干井)设施,高低温干井分别检测电偶的特殊点温度值误差和能否用于实验的合格性进行甄别筛选。它即是本实验的检测校正部件,也是实验室的常备精密温度源。通常交国家法定技术监督部门定期检校确认合格,在有效期内使用。               
 
4电偶的布置及被灭菌物装载
    从国内许多温度验证工作开展与企业参观的实践中,专家都肯定被灭菌物装载及电偶的布置对温度验证结论有一定的影响。集中反映的问题有以下几方面:
    (1)电偶前端部分不要接触周边介质(被灭菌装载物,笼架,柜壁)。汽流和高温水流对其冲击不会发生碰撞接触和位移;
    (2)釜(胆)体喷淋板孔堵塞或加工飞边毛刺将影响水流及安置的设备平行度,也将影响水量分布和流向;
    (3)预测高温点(蒸汽入口)、低温点(凝结排放或循环水出口)与同步点(电偶位置与本柜设计检测探头处相同位置)的接线、编号与摆放方式有误。
    装载物(模拟灭菌生产类似物)的摆放模拟方式越接近实际生产,和影响热传递的模拟产品的液体粘度越接近灭菌药品粘度,摆放的电偶数量(10<N<20)越多越均匀,那么实验的可信度越大,真实误差越小,越逼真。< DIV>
    在2.4(3)所涉及点外,其余点选择视设备有所不同。如喷淋式灭菌柜,过热水是由上至下流动传递热量,验证技师强调堆码底层和堆码中心是考核重点,建议摆放在底层均布为重;又如SVP脉动灭菌釜,则强调堆码底层接近排气口周围的布置是考核重点;再如喷淋旋转式灭菌柜,过热水是由外至里流动传递热量,验证技师强调中剖面四角和中心是考核重点,建议摆放呈轴向中部层为重。而某些专家特别研究后,提出仍以可靠性和准确性为布置意图的核心思想。然而,需要对不同釜形作具体分析和实验注重均布性,取弱点代表。
    值得注意的是在设定灭菌程序一定(如121 ℃/15分,115℃/35分等)后,温度实验验证采取的实验设计参数,其装载方式和生产灭菌的正常采用方式是相同的、固定的,否则会造成检测偏差。特别强求的是,模拟生产现场条件的相似性和一致性是相当重要的条件因素。
    实际的LVP设备均为多笼车和大产量(有上万瓶/柜)的高效型。对冷点与次冷点的检测和判断必须是多次数据的综合结论。然而,使用过程存在冷点、次冷的漂移和改变属再验证确认。
    高温点的控制判断也是必须监测的参数,这将涉及到药品的高温药效评价。探头不足的情况下,可以固定装载形式后,经单笼车多次测试与对比,步步逼近搜寻冷点、次冷点、高温点等参数。同时,应和实际的生产装载形式一致,不得改变装载形式以保证应用偏差的最小化和数据的准确性。
    当然,按照生产现场的模拟情况步骤上应有最小装量和最大装量,每品每规至少3次(如设备太大,探头不够而分段测试,则数据将更多),至少3组稳定数据来考核设备的重现性和筛选热分布参数的准确性。
    加上校正、布置、辅助装载、检测、纪录分析等是验证班技工好几周的工作量。可见,试验的艰苦和细致要求,如此劳神费力是因为它的准确性对后面工作有十分重要的指导性意义。
 
5热穿透试验及标准灭菌时间F0
    热量在物理学中有传导、对流和辐射三种基本传递形式,其综合产生了强大的热穿透效果,人们关心的是热穿透效果,故取名为热穿透试验。早些书籍上有称它为带产品负荷的热分布试验,目前仍然以热穿透试验的称谓居多。目的是为了用前述实验的极值点来考核其F0值,对已经灭菌的产品是否被赋予设计的灭菌保证值进行具体数据检测考核。
    本实验的步骤和方法与装载和前述的热分布试验大体相同,差别在于温度探头的布置是插在产品中,不接触药品容器周边和底部。摆放在下列位置,并一一对应作好编号:
    (1)热分布试验确定的最冷点和次冷点;
    (2)热分布试验确定的最热点和次热点;
    (3)和灭菌柜温度控制设计探头并列(又称同步点);
    (4)纪录腔室温度探头(不插入产品中),其余和热分布位置相当,均匀布置。
    每点的温度纪录后按照时间间隔(30秒或1分)详细纪录打印,并计算每点从升温到降温过程中100℃上的F0值、各点总的F0均值、最大与最小值关键数据。
    探头使用前后都要在冰点槽和油浴槽中仔细的校正,剔除超差件。在保证重现性非常好的情况下,稳定试验数据不得低于3组。也就是本试验在某品种规格和对应某装载固定不变的工况下至少需稳定状态下作3次实验。可接受的标准是:
    (1)灭菌设计程序下各点热穿透试验获得的F0值基本一致;
    (2)最冷点F0值和产品的F0  均值之间差值小于2.5(参数的参考解释见《药品生产验证指南》1996版,221);
    (3)整体的F0值监察分析,其没有在设计的F0值允许波动的公差上下限外数据;
    (4)具备良好的重现性,连续三次以上重现性)。
    以F0值作为监察分析的历史由来已久,从经典的资料查阅可以找到,湿热灭菌中微生物杀灭的对数规则始于1921年Bigeow和Rahn等科学家的研究。他们论文的主要成果是:
    灭菌时微生物死亡遵循对数规则,过程可以用阿仑乌斯(Arrhenius)的一级反应式来描述。根据质量作用定律,在恒定温度及保持其它条件不改变的情况下,单位时间内被杀灭的微生物数正比于初始的原有数目,可以表示为以下的线性式:
    dN/dt = K (No-N ) …………(1)        
    整理后lg N t = lg No – ( K/2.303) t
    取其斜率的负倒数定义为D值,D= 2.303/K= t/ (lg N- lg N ),取(lg N- lg N )=1,D= t, 则为微生物被杀灭90%的时间。也称谓微生物九成杀灭时间,单位为分,D为正值。在USP中,D值则表示灭菌的程度。D值区分不同的微生物,在不同的温度和介质情况下数值不同,具体的数据是可以查阅的,其值越大表明微生物越难杀灭。
随着灭菌温度升高,杀灭耗用的时间越短。试验在(100~138℃)范围lg D与温度有线性关系,取其斜率的付倒数定义为Z值:
    Z  =  (T– T1 )/ lgD 1- lgD2 ---------------(2)
    Z值代表微生物被杀灭减低一个lg D数量单位所需升高的温度数值,代表微生物对热敏感系数,其值越大对热越不敏感。单位为℃ ,Z 为正值。实验选取强耐热菌株(嗜热脂肪杆菌B.Stearothermophilus)为代表的Z值在多种介质中为9.4 ,考虑Z值选取10,从安全角度既留有安全余地且对数计算应用上十分简便。
    D/ D  =  10 (T1 – T2) / Z    带入测试时间间隔Δt和效果时间多项累计求和,将T2设为参比温度T0,在变温情况下的灭菌等效式求F值计算整理,F值的数学表达式是一个多项和结果,也有直接以积分形式写出的代表式。数学多项表达式对物理特性表达较为直观: 
   
    Δt 为测量被灭菌物温度的时间间隔(一般采用1分或0.5分),分为单位;
    T为每个Δt时间间隔测得的被灭菌物温度值,℃为单位;
    T是参比温度值,℃为单位;
    Z为微生物数降低一个对数lgD值所需要升高的温度数,℃为单位;
    F ,分为单位。
    它的物理含义是在变温条件下t分钟灭菌效果与温度T (参比温度)时F分钟的灭菌效果相同等效。这是很有意义和具有非常适用价值的表达式,因为工业生产灭菌是不可能在一瞬间完成,长时间温度恒定不变的绝对理想状态也是不存在的,因而在实际的生产操作中将广泛涉及该式。
    当Z值取10℃时,这个数学表达式就剩下实测温度T和间隔时间Δt两个变量,代表各个温度值下的灭菌效果转化为121 ℃标准温度下Z值10℃下的灭菌时间效果,并记为F0
   
    上式直接由温度T和时间Δt两个物理量决定,某些书籍又称物理F0  (标准灭菌时间)。物理F0目前仅限于湿热灭菌,在试验中需要注意不能与干热、辐射等灭菌标准数据相混淆。
    它包括灭菌过程的升、保、降温过程三皆段热能对微生物总致死量效果,其是以时间为单位表示在灭菌温度121℃时等效的量值(以时间的量值来表示的代用值)。
    F0代用值能代表无菌吗?以  F0≥8为题展开,牵扯到一个容易和无菌概念混淆问题,在1995年前世界上许多从事无菌和灭菌产品的人们把F0≥8视为(当成)产品灭菌标准,好像F0≥8就等同达到产品无菌要求,而忽视其具体工艺污染控制手段问题。这是不对的,这对无菌要求在概念上属认识性的错误。
    F是指特定控制情况下被灭菌产品被污染的概率低于某值概念,赋予了产品一定的安全性而言,其是在制造过程(工艺)其他的染菌因素必须严格控制的特定情况下的。F0≥8在本设计程序下能杀灭到何种程度?是针对不同的产品和带有不同染菌数而设计的。不同染菌数样本可以在F0≥8状况下灭菌结束采取验算确认残存数或者辅之采样培养予以确认。在微生物失控情况下,根本不能称无菌。由此可见:
    没有严格的工艺制造过程染菌控制,即使F0≥8 也不能达到无菌要求,反之一样。所以,USP23(1211)不再提出将F0≥8即符合无菌要求的条款写入。因而,此概念也不能简单套用到其他无菌概念,也不能讲F0 达到多少后就达到无菌要求,这本不是同一概念。
    当然,在设计灭菌程序参数时应充分考虑增大被灭菌物的安全性,一般放大F0需作多次谨慎验证试验后才递出工艺修正报告。不能轻易放大F0,因为它是它是一把双刃剑,过度(过热)灭菌后果对药品来说很容易药效报废,并析出难以控制的杂质或(毒)副产物,毁坏药品质量,而造成一系列精心操作过程的前功尽弃,过度灭菌产品同样对病员无益。
    现在回头检查热穿透多次实验的结果。如已经达到可接受的标准了,则表明在灭菌柜最冷点(次冷点)以及最高温点(次高温点)的达到设计要求,极限点的数据表明灭菌是在设计操作程序可控制范围。既可保证腔内药品被赋予设计的足够安全性,又不在影响药效的过度灭菌温度范围。同时,同步点检测合格意味设备本身仪表反映的参数也是真实可靠,设备设计、制造与安装调试是合格的。这样为设备验证合格奠定了很好的基础,也为产品灭菌质量保证锁上了“第一把锁”。
 
6生物指示剂试验(也称为挑战性试验)
   涉及湿热灭菌的生物指示剂试验指将一定量的已知D值微生物耐热孢子接种到待灭菌的产品中,在设定的灭菌程序条件下限灭菌,以验证设定的灭菌工艺程序是否确实赋予产品所设定的F0值,由此进行的实验和评价过程也称为挑战性试验。操作步骤如下:
6.1验证方案制定的重点在产品的热稳定性、产品的污染水平与污染菌的耐热数据。
    (1)产品分析(接种模拟污染水平≥生产污染水平);
    (2)确定菌种孢子,选择强于产品常见污染菌的热耐受菌种孢子(菌种孢子含量的准确性,质量资料具备可追溯性,在有效期内);
    (3)选取非致病菌,且具有良好的重现性能;
    (4)应在接种同时留置多支阳性对照品,试验过程同步采样培养。
6.2充分采用热分布及热穿透的工作数据。
    装载和样品按照热穿透布置不变。特别关注灭菌釜的最冷点、次冷点以及同步点样品编号。
6.3设置试验温度灭菌限(也称低限灭菌)
    既低于设计值,比F低3 %~5%进行灭菌。由此而设计灭菌程序时间,如灭菌值F0 产品计算下限为8.5,设计为8.3限。
6.4按拟订下限灭菌程序结束
    (1)QC现场采样,试验编号数据和对照品编号数据同步收集;
    (2)样品按照确定菌种孢子培养要求(一般在特定温度和有好氧与厌氧条件区分);
    (3)实验样品和阳性品同条件分别培养观测。如阳性品正常培养失败,既可判试验无效而失败。因盾之不存,矛的锋利无从谈起。 
6.5为检测试验的重现性
    每一品种规格的灭菌程序至少应进行3次以上的试验,试验的数据必须稳定一致,重现性良好。否则,查找原因,重新开始。
    生物指示剂挑战性试验是一项典型的灭菌安全性评价验证,需要工艺人员试验技师和QC方面密切的配合和精确的设计。达到2.6.4与2.6.5可接受的标准后,可以证实试验成功,它代表工艺设计的灭菌程序与参数是合理的,也赋予了产品足够的安全性。另一方面,也证实前期设备的选择是符合生产需要的硬件。
    操作拟订的SOP、SMP把生产技术操作过程置于可控范围,至此本项验证工作可以告结束,转入下一项定期再验证流程。这样,为将来产品灭菌质量保证锁上了“第二把锁” 。
 
实例2
 
2.灭菌柜的验证
2.1评价标准和验证内容
    在1992年版世界卫生组织的《规范》第17章,提到对注射剂的验证要求:
    (1)17.32条:所有设备如灭菌柜、空气过滤系统、水处理系统(包括蒸馏水机)均应按计划进行验证、维护和监控。
    (2)17.55条:任何灭菌方法在正式采用前,该方法对产品的适用性以及每一装载方式下被灭菌品的所有部位是否达到规定灭菌要求都应经过验证。应定期进行再验证,每当设备有重大改变时,也须进行再验证。
    而在98版《药品GMP检查指南》中:
    (1)3102条:灭菌柜的能力是否与生产相适应,是否具有自动监测及记录装置。
    (2)*5703条:关键设备及无菌药品的验证内容是否包括灭菌设备、药液滤过及灌装(分装)系统。
    由上可见,灭菌工序对于注射剂生产的重要作用以及药政部门对灭菌柜验证的重视。而对于灭菌柜的验证,美国FDA和欧盟药品卫生组织对于不同的灭菌柜有具体的指引和要求(可以查阅有关的官方网页),我国在这方面只有02年版的《药品验证指南》大容量注射剂章节中给出对于灭菌柜验证的例子,同时05版的《药典》中关于灭菌法部分也给出更详细的要求。我们大多是参照它来制定评价标准的,笔者参考指南的例子把整个灭菌柜验证简单归纳为以下几个方面:
    (1)预确认,对灭菌柜的基本功能是否达到公司的要求进行确认;
    (2)安装确认,包括文件确认、图纸检查、主要机械部件检查、安全系统检查、公用管道连接检查、仪器仪表检查和校正、控制系统硬件部分检查、控制系统软件功能实现检查、备件备品的检查等;
    (3)运行确认,包括功能测试和基本性能参数的确认,以及对上述安装确认内容的运行时动态确认,同时根据实际情况修订操作规程和对操作人员进行实操培训;
    (4)性能确认,包括验证仪器的校验、空载热分布(腔室平均温度与冷点温差小于1.5℃)、满载热分布(腔室平均温度与冷点温差小于1.5℃)、满载热穿透的试验以及生物指示剂的挑战性试验。其中,最主要的衡量标准是灭菌阶段冷点和平均温度之差小于0.5℃和最终F0值大于8。
 
2.2灭菌柜验证操作过程
    关于预确认和安装与运行确认的内容在此省略,因为这和其他制药设备验证的基本准则是一样的。另需注意的是关于灭菌柜的安全部分和控制部分的确认,因为灭菌柜是压力容器,安全防护的措施和设置是必不可少的,这些措施既有机械方面的也应该有电器和PLC程序方面的,而灭菌效果如何则取决于控制程序和探头的精度等因素,所以要把握重点。在完成了以上的三种确认以后,就进入性能确认。
    (1)验证用的仪器,主要由三部分组成:高精度的测温探头(进口PT100热电阻温度探头)、用微机制成的测温和传送集成系统以及手提电脑(主要是电脑上用VB编写的和数据库连接的验证仪记录软件)。
    (2)使用以前当然就是要进行校正。
    (3)校正完了以后就按照布点图进行布点。1)空载热分布是指柜内不放任何玻璃瓶,只放空的灭菌架进入腔体;2)满载热分布是指按最大装载量把玻璃瓶放满灭菌架中,然后探头是放于瓶外去测温,看瓶外的温度变化;3)满载热穿透的玻璃瓶放置方法和跟满载热分布一样,只是温度检测探头的位置不一样,满载热穿透是把探头放置于盛满药液或水的瓶子中紧固,用于探测瓶内温度。
    以上每个阶段都需要进行至少连续运行3次。这里需要注意的是不同的规格都需要按最大装载量去放置,而且要按正常灭菌的程序进行灭菌,不然就失去验证的意义了(当然也可以进行挑战性试验,适当降低灭菌温度,这里不作详述),而我们在这个过程只需要观察数据就可以了。
    还有用生物指示剂进行挑战性试验,生物指示剂的选用可根据药典,但应强调所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性,用量也应大于产品中该污染菌的水平,经生物指示剂验证后,应能证明在设定的F0值条件下,产品的无菌保证水平低于106
    (4)最后验证完要对温度探头进行再次校正,验证前后偏差均应小于0.5℃为合格。
 
2.3灭菌柜验证数据分析
    验证过程做完了,轮到最关心的数据分析阶段,有很多人只关心结论是否合格?可以生产了吗?其实这是错误的,验证的核心思想是通过验证过程发现问题,了解灭菌柜的实际工作状况(特别是每年的再验证更是如此),从而解决问题,为日后的维护和检查提供依据与对照,才能知晓这个柜控制是否合理、精度如何、是否年久失修等,有经验的人就能通过对比数据就能看出来,让灭菌柜更稳定地工作才是验证目的。
    水浴式非旋转的灭菌柜温度分布特点是怎样的呢?总的来说,柜底近排水位置会相对低一些,至于哪一边温度低些则可能取决于灭菌柜的安装水平度或者由于喷淋头的堵塞状况,而柜的中间位置温度会相对温度高一些。(图3)是一个非旋转水浴式灭菌柜满载热穿透灭菌过程的温度曲线图,从上图可以看出非旋转水浴式灭菌柜柜内各点的热分布还是比较均匀的,比蒸汽式灭菌柜要好很多,但又比旋转水浴式灭菌柜要差一些,也许这就是非旋转水浴式灭菌柜成为主流灭菌柜的原因吧。


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